ЖИ́ДКОСТНА́Я ХРОМАТОГРА́ФИЯ

ЖИ́ДКОСТНА́Я ХРОМАТОГРА́ФИЯ, ме­тод раз­де­ле­ния, иден­ти­фи­ка­ции, ко­ли­че­ст­вен­но­го оп­ре­де­ле­ния и фи­зи­ко-хи­мич. ис­сле­до­ва­ния ве­ществ; вид хро­ма­то­гра­фии, в ко­то­рой в ка­че­ст­ве под­виж­ной фа­зы (элю­ен­та) ис­поль­зу­ет­ся жид­кость.

Историческая справка

Хро­ма­то­гра­фия от­кры­та М. С. Цве­том в 1903 в ви­де ко­ло­ноч­но­го жид­ко­ст­но-ад­сорб­ци­он­но­го ме­то­да. Бо­лее по­лу­ве­ка прак­тич. при­ме­не­ние ме­то­да бы­ло ог­ра­ни­че­но пре­па­ра­тив­ным вы­де­ле­ни­ем ве­ществ в чис­том ви­де ио­но­об­мен­ны­ми про­цес­са­ми раз­де­ле­ния ред­ко­зе­мель­ных и транс­ура­но­вых эле­мен­тов. Для ана­ли­тич. це­лей ме­тод не ис­поль­зо­вал­ся в свя­зи с дли­тель­но­стью (до не­сколь­ких ча­сов) экс­пе­ри­мен­та, ко­то­рая бы­ла обу­слов­ле­на не­сколь­ки­ми фак­то­ра­ми (при­ме­не­ни­ем ад­сор­бен­тов с раз­ме­ром зё­рен бо­лее 50–100 мкм, про­хо­ж­де­ни­ем элю­ен­та че­рез ко­лон­ку под дей­ст­ви­ем толь­ко си­лы тя­же­сти, от­сут­ст­ви­ем про­точ­ных де­тек­то­ров). Экс­пресс­ная ана­ли­тич. Ж. х. соз­да­на в 1960–70-х гг., при­чём ус­ко­ре­ние мас­со­об­ме­на ме­ж­ду под­виж­ной и не­по­движ­ной фа­за­ми – уве­ли­че­ние ско­ро­сти раз­де­ле­ния – бы­ло дос­тиг­ну­то за счёт умень­шения диа­мет­ра зё­рен ад­сор­бен­тов. Ис­поль­зо­ва­ние мел­ких (5–10 мкм) зё­рен по­тре­бо­ва­ло, из-за воз­ник­ше­го боль­шо­го вход­но­го дав­ле­ния, при­ме­не­ния на­со­сов вы­со­ко­го дав­ле­ния и при­ве­ло к раз­ра­бот­ке Ж. х. вы­со­ко­го дав­ле­ния. Эф­фек­тив­ность ко­ло­нок при пе­ре­хо­де к мел­ким фрак­ци­ям ад­сор­бен­та су­ще­ст­вен­но воз­рос­ла (в рас­чё­те на еди­ни­цу дли­ны в неск. со­тен раз пре­вы­си­ла эф­фек­тив­ность ко­ло­нок в га­зо­вой хро­ма­то­гра­фии), по­это­му совр. экс­пресс­ную ана­ли­тич. Ж. х. с ис­поль­зо­ва­ни­ем жё­ст­ких ад­сор­бен­тов мел­ко­го зер­не­ния, на­со­сов вы­со­ко­го (св. 20 МПа) дав­ле­ния и про­точ­ных де­тек­то­ров на­зы­ва­ют вы­со­ко­эф­фек­тив­ной жид­ко­ст­ной хро­ма­то­гра­фи­ей (ВЭЖХ). По вре­ме­нам раз­де­ле­ния ВЭЖХ не ус­ту­па­ет га­зо­вой хро­ма­то­гра­фии, по об­лас­тям при­ме­не­ния зна­чи­тель­но её пре­вос­хо­дит.

Основные методы

Пред­ло­же­но неск. де­сят­ков ме­то­дов и ва­ри­ан­тов Ж. х., ко­то­рые по­зво­ля­ют раз­де­лять сме­си со­еди­не­ний с мо­ле­ку­ляр­ны­ми мас­са­ми от 50 до не­сколь­ких млн., вклю­чая изо­ме­ры (в т. ч. оп­ти­че­ские), мак­ро­мо­ле­ку­лы син­те­ти­че­ских и био­по­ли­ме­ров, ио­ны, ста­биль­ные ра­ди­ка­лы, ви­ру­сы и др. мик­ро­час­ти­цы.

По ме­ха­низ­му раз­де­ле­ния вы­де­ля­ют сле­дую­щие осн. ме­то­ды Ж. х.: ад­сорб­ци­он­ный – раз­де­ле­ние про­ис­хо­дит за счёт разл. ад­сор­би­руе­мо­сти ком­по­нен­тов сме­си на по­верх­но­сти твёр­до­го те­ла (ад­сор­бен­та); рас­пре­де­ли­тель­ный – раз­де­ле­ние за счёт разл. рас­тво­ри­мо­сти в плён­ке жид­кой фа­зы, на­не­сён­ной на по­верх­ность твёр­до­го но­си­те­ля; ио­но­об­мен­ный (ион­ный, ион-пар­ный) – за счёт разл. спо­соб­но­сти раз­де­ляе­мых ио­нов в рас­тво­ре к ион­но­му об­ме­ну с ио­ни­том – не­под­виж­ной фа­зой (см. в ст. Ио­но­об­мен­ная хро­ма­то­гра­фия); экс­клю­зи­он­ный (мо­ле­ку­ляр­но-си­то­вый, гель-фильт­ра­ци­он­ный, гель-про­ни­каю­щий) – раз­де­ле­ние мак­ро­мо­ле­кул по­ли­ме­ров, а так­же ма­лых мо­ле­кул и ио­нов за счёт разл. раз­ме­ров или фор­мы и спо­соб­но­сти про­ни­кать в по­ры не­ио­но­ген­но­го ге­ля – непод­виж­ной фа­зы (см. в ст. Экс­клю­зи­он­ная хро­ма­то­гра­фия); аф­фин­ный (био­спе­ци­фи­че­ский) – раз­де­ле­ние био­ло­ги­че­ски ак­тив­ных со­еди­не­ний за счёт био­спе­ци­фич. взаи­мо­дей­ст­вий с ком­пле­мен­тар­ны­ми сорб­ци­он­ны­ми цен­тра­ми не­под­виж­ной фа­зы (см. в ст. Аф­фин­ная хро­ма­то­гра­фия); ли­ган­до­об­мен­ный – раз­де­ле­ние за счёт разл. спо­соб­но­сти раз­де­ляе­мых со­еди­не­ний к ком­плек­со­об­ра­зо­ва­нию с ка­тио­на­ми ме­тал­лов или функ­цио­наль­ны­ми груп­па­ми не­под­виж­ной фа­зы; хи­раль­ный (энан­тио­се­лек­тив­ный) – раз­де­ле­ние энан­тио­ме­ров за счёт взаи­мо­дей­ст­вия с хи­раль­ны­ми груп­па­ми не­под­виж­ной или под­виж­ной фа­зы, а так­же ряд др. ме­то­дов. К совр. ме­то­дам от­но­сят­ся про­ти­во­точ­ная, мем­бран­ная, вы­со­ко­тем­пе­ра­тур­ная, цир­ку­ля­ци­он­ная, мно­го­мер­ная и др. ва­ри­ан­ты жид­ко­ст­ной хро­ма­то­гра­фии.

Основные параметры

Из­ме­ряе­мые ве­ли­чи­ны, ха­рак­те­ри­зую­щие Ж. х., сле­дую­щие: па­ра­мет­ры удер­жи­ва­ния (вре­мя удер­жи­ва­ния $t_\text{R}$, объ­ём удер­жи­ва­ния $V_\text{R}$ и фак­тор удер­жи­ва­ния), эф­фек­тив­ность ко­лон­ки (чис­ло тео­ре­тич. та­ре­лок $N$ или вы­со­та, эк­ви­ва­лент­ная од­ной тео­ре­тич. та­рел­ке, $H$), се­лек­тив­ность раз­де­ле­ния (ко­эф. се­лек­тив­но­сти $α$  – от­но­ше­ние вре­ме­ни удер­жи­ва­ния двух со­сед­них пи­ков на хро­ма­то­грам­ме), сте­пень раз­де­ле­ния (от­но­ше­ние раз­но­сти удер­жи­ва­ния двух со­сед­них пи­ков к сум­ме по­лу­ши­рин этих пи­ков, $R$). 

На раз­де­ле­ние влия­ет темп-ра, рас­ход и при­ро­да под­виж­ной фа­зы. В за­ви­си­мо­сти от при­ро­ды под­виж­ной фа­зы ме­ня­ет­ся её элюи­рую­щая спо­соб­ность. В Ж. х. при­ме­ня­ют изо­кра­ти­че­ский ре­жим элюи­ро­ва­ния (под­виж­ной фа­зой с по­сто­ян­ной элюи­рую­щей спо­соб­но­стью) и гра­ди­ент­ный (под­виж­ной фа­зой с уве­ли­чи­ваю­щей­ся во вре­ме­ни элюи­рую­щей спо­соб­но­стью).

Се­лек­тив­ность раз­де­ле­ния свя­за­на с при­ро­дой меж­мо­ле­ку­ляр­ных взаи­мо­дей­ст­вий сор­бат – сор­бент, сор­бат – элю­ент, элю­ент – сор­бент. В совр. ва­ри­ан­тах Ж. х. учи­ты­ва­ет­ся влия­ние на ха­рак­тер этих взаи­мо­дей­ст­вий гео­мет­рич. струк­ту­ры (напр., при ис­поль­зо­ва­нии сор­бен­тов на ос­но­ве цик­ло­дек­ст­ри­нов, жид­ких кри­стал­лов, кра­ун-эфи­ров), био­ло­гич. и хи­мич. ак­тив­но­сти мо­ле­кул, а так­же воз­мож­ность раз­де­ле­ния (в ча­ст­но­сти, по­ли­ме­ров) в кри­тич. ус­ло­ви­ях; осу­ще­ст­в­ля­ет­ся ком­пь­ю­тер­ная оп­ти­ми­за­ция.

Проведение процесса

Жид­ко­ст­ные хро­ма­то­гра­фы со­сто­ят из ём­ко­сти для элю­ен­та, на­со­са вы­со­ко­го дав­ле­ния (10–40 МПа), кра­на-до­за­то­ра, за­щит­ной и ана­ли­тич. ко­ло­нок, де­тек­то­ра, элек­трон­но­го бло­ка де­тек­то­ра (бло­ка пи­та­ния, уси­ли­те­ля, ана­ло­го-циф­ро­во­го пре­об­ра­зо­ва­те­ля), тер­мо­ста­тов ко­лон­ки и ячей­ки де­тек­то­ра; для об­ра­бот­ки ин­фор­ма­ции ис­поль­зу­ют­ся ком­пь­ю­те­ры.

В ВЭЖХ при­ме­ня­ет­ся бо­лее 20 ти­пов де­тек­ти­рую­щих сис­тем; са­мые рас­про­стра­нён­ные – спек­тро­фо­то­мет­ри­че­ские, в т. ч. про­грам­ми­руе­мые, с ди­од­ной мат­ри­цей (диа­па­зон длин волн 200–900 нм), флуо­рес­цент­ные, элек­тро­хи­ми­че­ские, масс-спек­тро­мет­ри­че­ские, реф­рак­то­мет­ри­че­ские, по све­то­рас­сея­нию. В ме­ди­ци­не, био­ло­гии, фар­ма­цев­ти­ке (при рас­шиф­ров­ке дей­ст­вую­щих на­чал экс­трак­тов ле­кар­ст­вен­ных рас­те­ний) и в др. об­лас­тях ши­ро­ко ис­поль­зу­ют­ся гиб­рид­ные ме­то­ды, со­че­таю­щие Ж. х. и масс-спек­тро­мет­рию (с сис­те­мой вво­да про­бы в спек­тро­метр ме­то­дом элек­тро­рас­пы­ле­ния – элек­тро­спрей), ЯМР- или ИК-спек­тро­ско­пию. Пре­де­лы об­на­ру­же­ния дос­ти­га­ют 10^–15–10^–9 г.

Для раз­де­ле­ния ком­по­нен­тов ис­поль­зу­ют ана­ли­тич. на­са­доч­ные (внутр. диа­метр 2,0–4,6мм), мик­ро­на­са­доч­ные (диа­метр 0,5–1,0 мм), ка­пил­ляр­ные (диа­метр ме­нее 0,05 мм; сорб­ци­он­ный слой им­мо­би­ли­зо­ван на внутр. стен­ках ка­пил­ля­ра), а так­же пре­па­ра­тив­ные ко­лон­ки (диа­метр бо­лее 10 мм). Дли­на на­са­доч­ных ко­ло­нок 5, 10, 15, 25 см. Раз­мер зё­рен сор­бен­та 1–10 мкм (ча­ще все­го сфе­рич. час­ти­цы диа­мет­ром 5 мкм).

В за­ви­си­мо­сти от при­ро­ды раз­де­ляемых со­еди­не­ний ис­поль­зу­ют об­ра­щён­но-фа­зо­вую хро­ма­то­гра­фию (ОФХ) или нор­маль­но-фа­зо­вую хро­ма­то­гра­фию (НФХ). В ОФХ сор­бент (не­под­виж­ная фа­за) ме­нее по­ля­рен, чем под­виж­ная фа­за (элю­ент), в НФХ – бо­лее по­ля­рен. В пер­вом слу­чае удер­жи­ва­ние воз­рас­тает с рос­том гид­ро­фоб­но­сти мо­ле­кул раз­де­ляе­мой сме­си, во вто­ром – с рос­том по­ляр­но­сти мо­ле­кул. В ОФХ в ка­че­ст­ве сор­бен­тов ис­поль­зу­ют си­ли­ка­гель с хи­ми­че­ски при­ви­ты­ми к по­верх­но­сти ал­киль­ны­ми це­пя­ми С₁–С₃₀ (ча­ще все­го С₈ или С₁₈), в ка­че­ст­ве элю­ен­тов – сме­си ме­та­нол – во­да, аце­то­нит­рил – во­да и др. с раз­ным со­от­но­ше­ни­ем ком­по­нен­тов. В НФХ в ка­че­ст­ве сор­бен­тов при­ме­ня­ют по­рис­тый си­ли­ка­гель, си­ли­ка­гель с при­ви­ты­ми нит­риль­ны­ми и ами­но­груп­па­ми. В ОФХ и в НФХ при­ме­ня­ют так­же по­ли­мер­ные и уг­ле­род­ные сор­бен­ты. Ис­ход­ные по­рис­тые сор­бен­ты обыч­но име­ют удель­ную по­верх­ность в пре­де­лах 100–400 м²/г, сред­ний диа­метр пор 8, 10, 20, 30 нм. При вы­бо­ре сор­бен­та оце­ни­ва­ют эф­фек­тив­ность, па­ра­мет­ры удер­жи­ва­ния, гид­ро­фоб­ность, сте­ри­че­скую се­лек­тив­ность, спо­соб­ность об­ра­зо­вы­вать во­до­род­ные свя­зи, ио­но­об­мен­ную ём­кость и др. фак­то­ры.

Раз­ра­бо­та­ны тех­но­ло­гии по­лу­че­ния но­вых сор­бен­тов и ко­ло­нок для ВЭЖХ, в ча­ст­но­сти сор­бен­тов для пер­фу­зи­он­ной хро­ма­то­гра­фии, мо­но­лит­ных ко­ло­нок, по­рис­тых по­ли­ме­ров с по­ра­ми мо­ле­ку­ляр­ных раз­ме­ров, мак­ро­по­рис­тых уг­ле­род­ных сор­бен­тов. В пер­фу­зи­он­ных ко­лон­ках мик­ро­по­то­ки элю­ен­та про­хо­дят че­рез от­кры­тые мак­ро­по­ры сор­бен­та, что при­во­дит к умень­ше­нию раз­мы­ва­ния хро­ма­то­гра­фич. пи­ков по срав­не­нию с обыч­ны­ми на­са­доч­ны­ми ко­лон­ка­ми. В мо­но­лит­ных ко­лон­ках сплош­ной сорб­ци­он­ный слой соз­да­ёт­ся не­по­сред­ст­вен­но в ко­лон­ке, напр. в ви­де жё­ст­ко­го по­рис­то­го по­ли­мер­но­го бло­ка.

Области применения

ВЭЖХ ис­поль­зу­ет­ся в био­ло­гии и био­тех­но­ло­гии (в т. ч. при рас­шиф­ров­ке ге­но­ма че­ло­ве­ка, ре­ше­нии за­дач про­те­о­ми­ки, пеп­ти­до­ми­ки, ме­та­бо­ло­ми­ки), в ме­ди­ци­не (напр., для ран­ней ди­аг­но­сти­ки за­бо­ле­ва­ний с ис­поль­зо­ва­ни­ем био­хи­мич. мар­ке­ров), в фар­ма­цев­ти­ке при соз­да­нии но­вых ле­карств и ана­ли­зе их чис­то­ты (в т. ч. энан­тио­мер­ной), в су­деб­но-мед. экс­пер­ти­зах, в кон­тро­ле ок­ру­жаю­щей сре­ды и пром. вы­бро­сов, тех­но­ло­гич. про­цес­сов и ка­че­ст­ва про­дук­ции в хи­мич., неф­те­хи­мич., пи­ще­вой, мик­ро­био­ло­гич. пром-сти. Пре­па­ра­тив­ную Ж. х. ис­поль­зу­ют для вы­де­ле­ния и очи­ст­ки мн. при­род­ных и син­те­тич. ве­ществ, в т. ч. био­ло­ги­че­ски ак­тив­ных со­еди­не­ний, ви­ру­сов (грип­па, эн­це­фа­ли­та и др.), бел­ков и по­ли­пеп­ти­дов; в пром-сти – фул­ле­ре­нов, ин­су­ли­на, са­по­ни­нов, ин­тер­лей­ки­на-2 че­ло­ве­ка, гис­то­нов, плаз­мид ДНК, ан­ти­био­ти­ков, оп­тич. изо­ме­ров и др.