Фосфорили́рование, замещение в молекуле органических соединений атома водорода остатками кислот фосфора, чаще всего ортофосфорной кислоты. В широком смысле – замещение любого атома или группы атомов на остаток фосфорсодержащей кислоты или введение остатка такой кислоты в молекулу любыми другими способами. Легче всего фосфорилируются первичные и вторичные амины, спирты, меркаптаны и другие нуклеофилы. В качестве фосфорилирующих агентов используют галогенангидриды и ангидриды, реже – амиды и сами кислоты фосфора. Фосфорилирование применяется для синтеза негорючих материалов, пластификаторов, экстрагентов, пестицидов, лекарственных средств и др.

Биологическое фосфорилирование играет важную роль в обмене веществ и энергии в клетках (в процессах окисления, при синтезе белков, нуклеиновых кислот и др.); в частности, ресинтез АТФ в клетке осуществляется в аэробных условиях при окислительном фосфорилировании или в анаэробных условиях при фотосинтезе и гликолизе. Фосфорилирование некоторых ферментов приводит к их ингибированию (например, многие фосфорорганические соединения, в том числе фосфорорганические отравляющие вещества, способны фосфорилировать ацетилхолинэстеразу, регулирующую процессы передачи нервных импульсов).